Prolomení ústní bariéry（3）

Objev, optimalizace a následná modifikace PN-235 (icotrokinra, JN-2113)

Výhody perorálně podávaných cyklických peptidů byly podrobně popsány v předchozích článcích, přičemž PN-235 je věnována značná pozornost jako jednomu z velmi mála cyklických peptidových léčiv v současnosti dostupných pro perorální podávání. července 2025 Protagonist a Janssen oznámili, že předložili FDA žádost o nový lék (NDA) pro přípravek Icotrokinra pro léčbu středně těžké až těžké ložiskové psoriázy u dospělých a dětí ve věku 12 let a starších. Pokud bude Icotrokinra schválena, očekává se, že se stane prvním perorálním lékem na světě zaměřeným na IL-23R pro léčbu psoriázy. Tento článek se zaměřuje na proces objevování a systematické optimalizační strategie této molekuly, přičemž jako časovou osu používá data zveřejnění patentu a také shrnuje potenciální směry pro další optimalizaci.

Již v roce 2007 podala společnost Valorisation Hsj, Societe En Commandite patentovou přihlášku na antagonisty IL-23R peptidu (WO2009007849). Toto je jeden z prvních patentů zahrnujících antagonisty IL-23R peptidu ve veřejně dostupných informacích. Tento patent popisuje sérii peptidů zacílených na IL-23R, včetně agonisty APG-2301 a antagonistů APG-2303, APG-2305, APG-2307 a APG-2309 (sekvence znázorněné na obrázku níže). Tým použil aminokyselinovou sekvenci IL-23R jako základ v kombinaci s technikami počítačového modelování k vytvoření lineárních peptidů odpovídajících jeho pantové oblasti (napodobující IL-23 a působící jako antagonisté IL-23R). Mezi nimi APG-2305 a APG-2309 účinně inhibovaly fosforylaci STAT3 v myších splenocytech in vitro, s hodnotami IC50 1 nM a 2 nM, v daném pořadí. Kromě toho u potkaního modelu IBD léčba APG-2309 významně zmírnila zánětem indukovaný edém a zarudnutí a významně snížila infiltraci slizničních leukocytů a vaskulární kongesci, což prokázalo dobrý protizánětlivý a terapeutický potenciál.

V roce 2013 zveřejnila společnost Medical Diagnostic Laboratories (MDL) patent (US20130029907) popisující objev peptidů vázajících IL-23R- pomocí technologie fágového displeje, přičemž se podařilo identifikovat několik peptidových sekvencí, které se specificky vážou na IL-23R. Tento výzkum zkonstruoval knihovnu M13 fágového displeje obsahující náhodné 12-merní peptidové sekvence a provedl několik kol screeningu s použitím rozpustného rekombinantního IL-23R plné délky a jeho sestřihových variant jako cílů. Nakonec bylo identifikováno 27 peptidů s vazebnou aktivitou. Je pozoruhodné, že tyto peptidové sekvence vykazovaly nízkou podobnost s krystalovou strukturou IL-23, kterou uvádí Beyer et al. (PDB ID: 3D85). Prostřednictvím zarovnání sekvencí vědci zjistili, že 66,7 % peptidů obsahovalo konzervovanou rozpoznávací sekvenci: -WX1X2X3W-, o které se předpokládalo, že je klíčovým funkčním motivem pro vazbu na IL-23R a blokování jeho následné signální transdukce (reprezentativní sekvence je znázorněna na obrázku níže). Následně vědci vyhodnotili inhibiční aktivitu peptidů na vazbu IL-23 na IL-23R pomocí kompetitivních experimentů ELISA, přičemž identifikovali Peptid 23 (12merní peptid) jako nejaktivnější peptid, který významně inhiboval vazbu IL-23 na IL-23R (IC50=0.85 µM).

Na základě toho tým optimalizoval strukturu Peptidu 23, včetně prodloužení nebo zkrácení C/N konců, nahrazení vnitřních aminokyselin kyselými/neutrálními/bazickými aminokyselinami a cyklizačních modifikací. Výsledky kompetitivní ELISA ukázaly, že prodloužení aminokyselin na obou koncích Peptidu 23 mělo malý vliv na jeho inhibiční aktivitu, ale zkrácení vedlo ke snížení inhibiční aktivity. Úprava vlastností náboje zbytků "X" v motivu jádra -WX1X2X3W- (např. nahrazení záporně nabitých zbytků jinými záporně nabitými, polárními nenabitými nebo kladně nabitými zbytky) významně neovlivnila jeho inhibiční aktivitu, což naznačuje, že nábojové charakteristiky zbytků v této oblasti nejsou klíčovými determinanty vazebné aktivity. Nahrazení jednoho z tryptofanových (W) zbytků v jádrové struktuře fenylalaninem (F) nebo tyrosinem (Y) si zachovalo svou inhibiční schopnost, zatímco jeho nahrazení alaninem (A) snížilo aktivitu, což je v souladu se sekvenčními charakteristikami získanými z předchozího screeningu fágového displeje.

Kromě toho zkrácení Peptidu 23.15 při zachování struktury jádra -WQDYW-, ačkoli byl motiv jádra zachován, významně oslabilo jeho inhibiční aktivitu. Navíc zavedení cysteinu (Cys) na obou koncích za vzniku cyklického peptidu vedlo k aktivitě srovnatelné s lineárním peptidem; avšak zmenšení velikosti cyklického peptidu na 7 nebo 9 peptidů při zachování struktury jádra významně oslabilo jeho schopnost inhibovat IL-23R.

Ve dvou následujících patentech publikovaných MDL (US20130172272 a US20160039878) výzkumníci použili základní strukturu -WX1X2X3W- jako lešení a zkonstruovali a prověřili cílenou peptidovou knihovnu pomocí technologie zobrazování ribozomů (sekvence peptidové knihovny: XXXWXXYWXXXX). Po osmi kolech screeningu byly peptidy dále rozděleny na základě struktury -WX1X2YW-: Skupina A obsahovala -WVDYW-, skupina B obsahovala -WQDYW- a skupina C obsahovala peptidy s jinými základními sekvencemi. Testy aktivity ELISA ukázaly, že Peptid č. . 2/7 ve skupině A měl lepší aktivitu ve srovnání s Peptidem č V kompetitivních testech ELISA měl peptid č. . 7 IC50 58,0 nM a peptid č. . 2 měl IC50 34,6 nM.

Následně za použití peptidu č. 2 a peptidu č. 7 jako výchozích bodů byly navrženy a syntetizovány tři cyklické peptidy: 2HT-AA, 7-CC a 7HT-AA. Mezi nimi molekula 2HT-AA založená na cyklizaci alaninových zbytků od hlavy k-ocasu na obou koncích peptidu č. 2 vykazovala nejlepší aktivitu (struktura je znázorněna na obrázku níže) s kompetitivní ELISA IC50 8,1 nM a reportérovou aktivitou 26n}24138 (testování 341. stimulovala DB buněčnou linii transfektovanou reportérovým genem STAT3 a inhibiční aktivita byla kvantifikována detekcí exprese reportérového genu). To představovalo 4-}6násobné zvýšení aktivity ve srovnání s lineárním peptidem. V in vitro testech aktivity 2HT-AA účinně inhiboval IL-23-indukovanou sekreci IL-17F v lidských Th17 buňkách způsobem závislým na koncentraci a blokoval produkci IL-22 v lidských PBMC a potkaních splenocytech. Současně tento cyklický peptid také downreguloval hladiny IL-17F mRNA v krysích splenocytech. Naneštěstí, navzdory slibné farmakologické aktivitě 2HT-AA, nebyly nalezeny žádné následné zprávy o optimalizaci této cyklické peptidové struktury a jejích derivátů pomocí MDL.